Karakterisering en engineering van een polysaccharide mono-oxygenase betrokken in de afbraak van (ligno)cellulose biomassa

Plantencellen hebben de bijzondere eigenschap dat ze naast een celmembraan ook omgeven zijn door een rigide lignocellulose celwand.

 

De cellulose matrix is recalcitrant waardoor de samenwerking van verschillende enzymen nodig is voor zijn afbraak. Een synergetische werking wordt verondersteld waarbij LPMO enzymen (lytic polysaccharide mono-oxygenases, GH61) de kristallijne vorm van cellulose  beschikbaar stellen voor de klassieke exo- en endocellulasen. Dit recent ontdekte mechanisme zou wel eens de sleutel tot een rendabel cellulose-afbraak proces kunnen zijn.

Het doel van dit onderzoeksproject is om twee enzymen uit de GH61 familie (Trichoderma reesei, Cel 61A en Phanarochaete chrysosporium, Cel61D) te optimaliseren voor industriële cellulose afbraak met een hogere efficiëntie dan die vandaag de dag bestaat. Concreet zal het GH61 enzym geoptimaliseerd worden naar thermostabiliteit en conversie snelheid.

De strategie die aangewend zal worden voor de optimalisatie is directed evolution via semi-rationeel design. Concreet zullen wij Iterative Saturation Mutagenesis (ISM) toepassen. De interessante posities worden gebaseerd op locaties met hoge flexibiliteit (hoge B-factor) met het oog op een hogere thermostabiliteit (B-FIT methode). Vervolgens worden posities uit de actieve site (CASTing methode) aangepast. Ook zullen we gebruik maken van homology modelling, ligand docking en degeneratieve codons om zo snel mogelijk het beste resultaat te bekomen. Hiertoe zullen we een hight-throughput screening methode op punt moeten stellen om de goede mutanten te selecteren. Semi-rational design lever kleinere bibliotheken, maar nog steeds 100’den mutanten om te evalueren. Tot op heden bestaat een dergelijke methode voor GH61 enzymen nog niet in hoge doorvoer formaat.

 

 

Contact: Magali Tanghe

Funding: IWT
Supervisor: Prof. Dr. T. Desmet

Co-supervisor: Dr. ing. Ingeborg Stals

Period: 2013 - 2016